久久免费成人黄片|一区二区婷婷在线视频|亚洲女V在线免费观看|免费福利视频一区二区三区|最新一区二区不卡视频在线|精品久久久久中文字幕一区|国产成人A在线观看视频免费|国产免费无码秘 一区二区三区

(1) 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備。包括純化重組蛋白及合成DNA探針。(2) 標(biāo)記探針。在合成的DNA探針上標(biāo)記放射性同位素³²P或生物素。由于生物素不具有放射性以及便于操作等優(yōu)點(diǎn), 近年來(lái)人們常使用生物素標(biāo)記DNA探針。按照以下順序配制標(biāo)記組和競(jìng)爭(zhēng)組的反應(yīng)體系。標(biāo)記組: 12.5 μL超純水, 5 μL5× TdT緩沖液, 2.5 μL 1 μmol?L^–1未標(biāo)記的Oligo, 2.5μL 5 μmol?L^–1 Biotin-11-UTP, 2.5 μL 2U?μL^–1 Diluted TdT。競(jìng)爭(zhēng)組: 20 μL超純水, 2.5μL 10×結(jié)合緩沖液(含Mg² ), 2.5 μL 50 μmol?L^–1未標(biāo)記的Oligo。37°C避光孵育30分鐘。加入1.25 μL 0.2 mol?L^–1 EDTA終止反應(yīng), 然后加入25 μL氯仿:異戊醇(1:1), 旋渦振蕩混勻, 16000 ×g離心1–2分鐘, 取上清。隨后轉(zhuǎn)移至90°C孵育2分鐘, 緩慢降溫至60°C, 最后于60°C孵育30分鐘。(3) 6% TBE凝膠制備及預(yù)電泳。按照配方依次加入各成分并充分混勻, 注意在灌膠過(guò)程中要防止氣泡的產(chǎn)生。待TBE凝膠完全凝固后開(kāi)始預(yù)電泳, 90 V電泳1–2小時(shí), 電泳緩沖液為0.5× TBE緩沖液。(4) 蛋白與探針結(jié)合反應(yīng)。按照以下配方配制結(jié)合反應(yīng)體系。實(shí)驗(yàn)組: 50 ng融合蛋白, 0.5–2μL標(biāo)記探針, 6 μL結(jié)合反應(yīng)緩沖液, 用超純水定容至20 μL。競(jìng)爭(zhēng)組: 50 ng融合蛋白, 0.5–2μL標(biāo)記探針, 過(guò)量的野生型未標(biāo)記探針或突變型未標(biāo)記探針, 6 μL結(jié)合反應(yīng)緩沖液, 用超純水定容至20 μL。其中, 結(jié)合緩沖液的配方為:2 μL 10×結(jié)合緩沖液, 1 μL 50%丙三醇, 1 μL100 mmol?L^–1 MgCl₂,1 μL 1 μg?μL^–1 Poly dI:dC, 1 μL 1% NP-40。  通常未標(biāo)記野生型或突變型探針的用量為標(biāo)記探針的10倍、50倍和100倍。Poly dI:dC可抑制蛋白與DNA的非特異性結(jié)合, 避免形成假?gòu)?fù)合物。(5) 電泳。結(jié)合反應(yīng)完畢后加入5 μL上樣緩沖液, 充分混勻再進(jìn)行上樣。電壓90 V, 待指示劑到達(dá)膠的3/4處時(shí)即可停止電泳。(6) 轉(zhuǎn)膜。將尼龍膜小心取出, 放入0.5× TBE轉(zhuǎn)膜緩沖液中, 依次按照黑面-纖維墊-2層濾紙-膠-尼龍膜-2層濾紙-纖維墊-白面的順序放置,注意不要有氣泡產(chǎn)生。380 mA工作60分鐘。(7) 紫外交聯(lián)。取出尼龍膜用吸水紙吸干水, 蛋白面朝下放入紫外交聯(lián)儀中, 紫外交聯(lián)15分鐘。(8) 發(fā)光檢測(cè)。將紫外交聯(lián)后的尼龍膜置于干凈的平皿中, 加入10 mL封閉緩沖液, 輕柔搖動(dòng)15分鐘。輕輕倒掉封閉緩沖液, 加入8 mL結(jié)合/封閉緩沖液, 輕柔搖動(dòng)15分鐘。將尼龍膜轉(zhuǎn)移至新的平皿中, 加入10 mL 1×漂洗液, 輕柔漂洗5分鐘, 重復(fù)漂洗3次。將尼龍膜轉(zhuǎn)移至新的平皿中, 加入15 mL底物平衡緩沖液, 輕柔搖動(dòng)15分鐘。取出尼龍膜, 吸干多余的底物平衡緩沖液, 置于新的平皿中。加入6 mL化學(xué)發(fā)光底物至完全覆蓋尼龍膜, 靜置孵育5分鐘。最后, 取出尼龍膜, 從側(cè)面吸干多余的化學(xué)發(fā)光底物, 用保鮮膜包被, 在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-step)中曝光5分鐘進(jìn)行顯影。(9)數(shù)據(jù)分析。通常情況下, 可以從兩方面分析EMSA數(shù)據(jù), 即底部的自由探針和位于上方的遷移條帶(蛋白-DNA復(fù)合物)。在加入等量標(biāo)記探針的前提下, 當(dāng)?shù)鞍着cDNA產(chǎn)生互作時(shí), 底部的自由探針減少, 遷移條帶亮度增強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上增加未標(biāo)記野生型探針會(huì)與標(biāo)記探針競(jìng)爭(zhēng)蛋白, 此時(shí)自由探針條帶強(qiáng)度基本不變, 遷移條帶亮度減弱; 而當(dāng)增加未標(biāo)記的突變探針時(shí), 由于蛋白不結(jié)合該序列,突變探針不與標(biāo)記探針競(jìng)爭(zhēng), 此時(shí)自由探針減少, 遷移條帶亮度增強(qiáng)(Jiang et al., 2016)。

一.材料和方法 （一）材料： Nuclear Extract Kit( Active Motif North America) 抽提核蛋白；BCA蛋白定量試劑盒；XXX細(xì)胞；抗體A； Merck Millipore ChromatinImmunoprecipitation Kit （Merck Millipore）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、1xPBS、 Penicillin streptomycin solution、0.25%胰酶溶液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Chemiluminescent Nucleic AcidDetection Module、Light Shift Chemilinescent EMSA Kit為美國(guó)Thermoscientific公司產(chǎn)品；Nuclear Extract Kit為Active Motif North America公司產(chǎn)品。 （二）方法 凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下： 1. 制備生物素標(biāo)記探針 1). 在Invitrogen公司合成探針序列，見(jiàn)下表。探針制備反應(yīng)體系為，25μl超純水、10μl的5×TdT Reaction Buffer、5μl探針(1μM)、5μl Biotin-N4-CTP、5μl TdT (2U/μl)溫和混勻，37℃反應(yīng)30min。 2). 加入2.5μl0.2M EDTA終止反應(yīng)；加入50μl氯仿，短暫渦旋振蕩，12000rpm離心2min，保留上層水相，-20℃保存；結(jié)合反應(yīng)前等體積混合兩條標(biāo)記引物，95℃退火引物，南京EMSA實(shí)驗(yàn)_烏魯木齊EMSA實(shí)驗(yàn)_西安淳風(fēng)生物科技有限公司，自然冷卻至室溫，4℃保存待用。 2. 抽提核蛋白 在250px培養(yǎng)皿中種植1×107個(gè)XXX細(xì)胞，培養(yǎng)約12h，收集細(xì)胞。用Nuclear Extract Kit – ActiveMotif North America 抽提核蛋白，并用BCA蛋白定量的方法測(cè)定蛋白濃度。 3. 制膠 配制6.5%的非變性膠，其配方如下：1ml10×TBE、3.3ml 40% Acrylamide、1ml 50% Glycerol、14.8ml dH2O、20μl TEMED（四甲基乙二氨），南京EMSA實(shí)驗(yàn)_長(zhǎng)沙EMSA實(shí)驗(yàn)_西安淳風(fēng)生物科技有限公司，混勻脫氣10min后再加入120μl 10%過(guò)硫酸氨（AP）混勻灌膠。 4. EMSA結(jié)合反應(yīng) 結(jié)合反應(yīng)體系為：2μl的10×Bindingbuffer、1μl的Poly(dIdC)、5μl的SGC7901 Nuclear extract（6μg/μl）、2μl的Biotin Probe（約12.5fmol/μl）、2μl的Antibody、dd H2O補(bǔ)齊20μl。另外，使用過(guò)量未標(biāo)記的冷探針進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)，即4ul的WT-probe（約12.5fmol/μl）；使用突變探針4μl的(Mut-probe)（約12.5fmol/μl）作為對(duì)照。使用相應(yīng)的抗體進(jìn)行超遷移率實(shí)驗(yàn)（Supershift assay）。 1) 將結(jié)合反應(yīng)的混合物用無(wú)菌槍頭輕輕的混合均勻，置于冰上反應(yīng)20min，然后加入生物素標(biāo)記的探針；室溫繼續(xù)反應(yīng)20min，加入6×LoadingBuffer(Takara)4μl，上樣體積為10~30μl，100V電泳至溴酚藍(lán)于四分之三凝膠處； 2) 進(jìn)行電轉(zhuǎn)前將NC膜浸泡于新鮮配制的0.5×TBE緩沖液中至少10min；以℃預(yù)冷的0.5×TBE為電轉(zhuǎn)緩沖液，在恒壓100V的條件下，至冰上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，約45min可完成轉(zhuǎn)膠于尼龍膜上；

鄭州全基因合成技術(shù)服務(wù)_醫(yī)藥、保養(yǎng)-西安淳風(fēng)生物科技有限公司
3) UV BOX下，以貼近膜一面面向紫外光源，以1200×100UJ/cm2，紫外交聯(lián)5min；加入25mLBlocking Buffer ，南京EMSA實(shí)驗(yàn)_沈陽(yáng)EMSA實(shí)驗(yàn)_西安淳風(fēng)生物科技有限公司，以約70rpm在脫色搖床上封閉30min； 4) 將66.7μl穩(wěn)定的鏈霉親和素（SA-HRP）以1:300稀釋于20ml Blocking Buffer，脫色搖床70rpm共軛結(jié)合作用20min； 5) 加入1×洗膜緩沖液，洗膜過(guò)程全部在脫色搖床上進(jìn)行（140prm)，完畢后wash buffer 30ml洗滌4次，每次15min； 6) 將膜用濾紙稍適吸干配制1:1稀釋的發(fā)光反應(yīng)液（Thermo公司，EMSA化學(xué)發(fā)光試劑盒）均勻的鋪于NC膜上，作用1-5min，趕走氣泡，于LAS4000上采集圖像，檢測(cè)信號(hào)。 實(shí)驗(yàn)原理 EMSA是一種研究轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù), 可用于定性和定量分析。通常將純化的蛋白和同位素或生物素標(biāo)記的DNA探針共同孵育, 然后在非變性聚丙烯凝膠上電泳, 從而將DNA-轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與不結(jié)合的探針?lè)蛛x。由于分子量變大, DNA-轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物比不結(jié)合的探針遷移速度慢, 因此轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合標(biāo)記探針后使自由探針含量減少。研究者通常按照上述2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)判斷轉(zhuǎn)錄因子是否結(jié)合DNA。

相關(guān)資訊查看