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(1) 實驗前準備。包括純化重組蛋白及合成DNA探針。(2) 標記探針。在合成的DNA探針上標記放射性同位素³²P或生物素。由于生物素不具有放射性以及便于操作等優(yōu)點, 近年來人們常使用生物素標記DNA探針。按照以下順序配制標記組和競爭組的反應體系。標記組: 12.5 μL超純水, 5 μL5× TdT緩沖液, 2.5 μL 1 μmol?L^–1未標記的Oligo, 2.5μL 5 μmol?L^–1 Biotin-11-UTP, 2.5 μL 2U?μL^–1 Diluted TdT。競爭組: 20 μL超純水, 2.5μL 10×結合緩沖液(含Mg² ), 2.5 μL 50 μmol?L^–1未標記的Oligo。37°C避光孵育30分鐘。加入1.25 μL 0.2 mol?L^–1 EDTA終止反應, 然后加入25 μL氯仿:異戊醇(1:1), 旋渦振蕩混勻, 16000 ×g離心1–2分鐘, 取上清。隨后轉移至90°C孵育2分鐘, 緩慢降溫至60°C, 最后于60°C孵育30分鐘。(3) 6% TBE凝膠制備及預電泳。按照配方依次加入各成分并充分混勻, 注意在灌膠過程中要防止氣泡的產生。待TBE凝膠完全凝固后開始預電泳, 90 V電泳1–2小時, 電泳緩沖液為0.5× TBE緩沖液。(4) 蛋白與探針結合反應。按照以下配方配制結合反應體系。實驗組: 50 ng融合蛋白, 0.5–2μL標記探針, 6 μL結合反應緩沖液, 用超純水定容至20 μL。競爭組: 50 ng融合蛋白, 0.5–2μL標記探針, 過量的野生型未標記探針或突變型未標記探針, 6 μL結合反應緩沖液, 用超純水定容至20 μL。其中, 結合緩沖液的配方為:2 μL 10×結合緩沖液, 1 μL 50%丙三醇, 1 μL100 mmol?L^–1 MgCl₂,1 μL 1 μg?μL^–1 Poly dI:dC, 1 μL 1% NP-40。  通常未標記野生型或突變型探針的用量為標記探針的10倍、50倍和100倍。Poly dI:dC可抑制蛋白與DNA的非特異性結合, 避免形成假復合物。(5) 電泳。結合反應完畢后加入5 μL上樣緩沖液, 充分混勻再進行上樣。電壓90 V, 待指示劑到達膠的3/4處時即可停止電泳。(6) 轉膜。將尼龍膜小心取出, 放入0.5× TBE轉膜緩沖液中, 依次按照黑面-纖維墊-2層濾紙-膠-尼龍膜-2層濾紙-纖維墊-白面的順序放置,注意不要有氣泡產生。380 mA工作60分鐘。(7) 紫外交聯(lián)。取出尼龍膜用吸水紙吸干水, 蛋白面朝下放入紫外交聯(lián)儀中, 紫外交聯(lián)15分鐘。(8) 發(fā)光檢測。將紫外交聯(lián)后的尼龍膜置于干凈的平皿中, 加入10 mL封閉緩沖液, 輕柔搖動15分鐘。輕輕倒掉封閉緩沖液, 加入8 mL結合/封閉緩沖液, 輕柔搖動15分鐘。將尼龍膜轉移至新的平皿中, 加入10 mL 1×漂洗液, 輕柔漂洗5分鐘, 重復漂洗3次。將尼龍膜轉移至新的平皿中, 加入15 mL底物平衡緩沖液, 輕柔搖動15分鐘。取出尼龍膜, 吸干多余的底物平衡緩沖液, 置于新的平皿中。加入6 mL化學發(fā)光底物至完全覆蓋尼龍膜, 靜置孵育5分鐘。最后, 取出尼龍膜, 從側面吸干多余的化學發(fā)光底物, 用保鮮膜包被, 在化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-step)中曝光5分鐘進行顯影。(9)數(shù)據(jù)分析。通常情況下, 可以從兩方面分析EMSA數(shù)據(jù), 即底部的自由探針和位于上方的遷移條帶(蛋白-DNA復合物)。在加入等量標記探針的前提下, 當?shù)鞍着cDNA產生互作時, 底部的自由探針減少, 遷移條帶亮度增強。在此基礎上增加未標記野生型探針會與標記探針競爭蛋白, 此時自由探針條帶強度基本不變, 遷移條帶亮度減弱; 而當增加未標記的突變探針時, 由于蛋白不結合該序列,突變探針不與標記探針競爭, 此時自由探針減少, 遷移條帶亮度增強(Jiang et al., 2016)。

一.材料和方法 （一）材料： Nuclear Extract Kit( Active Motif North America) 抽提核蛋白；BCA蛋白定量試劑盒；XXX細胞；抗體A； Merck Millipore ChromatinImmunoprecipitation Kit （Merck Millipore）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、1xPBS、 Penicillin streptomycin solution、0.25%胰酶溶液均購自美國Gibco公司；Chemiluminescent Nucleic AcidDetection Module、Light Shift Chemilinescent EMSA Kit為美國Thermoscientific公司產品；Nuclear Extract Kit為Active Motif North America公司產品。 （二）方法 凝膠遷移阻滯實驗的具體操作步驟如下： 1. 制備生物素標記探針 1). 在Invitrogen公司合成探針序列，見下表。探針制備反應體系為，25μl超純水、10μl的5×TdT Reaction Buffer、5μl探針(1μM)、5μl Biotin-N4-CTP、5μl TdT (2U/μl)溫和混勻，37℃反應30min。 2). 加入2.5μl0.2M EDTA終止反應；加入50μl氯仿，短暫渦旋振蕩，12000rpm離心2min，西北EMSA_濟南EMSA實驗外包_西安淳風生物科技有限公司，保留上層水相，-20℃保存；結合反應前等體積混合兩條標記引物，95℃退火引物，自然冷卻至室溫，4℃保存待用。 2. 抽提核蛋白 在250px培養(yǎng)皿中種植1×107個XXX細胞，培養(yǎng)約12h，收集細胞。用Nuclear Extract Kit – ActiveMotif North America 抽提核蛋白，并用BCA蛋白定量的方法測定蛋白濃度。 3. 制膠 配制6.5%的非變性膠，西北EMSA_沈陽EMSA技術服務_西安淳風生物科技有限公司，其配方如下：1ml10×TBE、3.3ml 40% Acrylamide、1ml 50% Glycerol、14.8ml dH2O、20μl TEMED（四甲基乙二氨），混勻脫氣10min后再加入120μl 10%過硫酸氨（AP）混勻灌膠。 4. EMSA結合反應 結合反應體系為：2μl的10×Bindingbuffer、1μl的Poly(dIdC)、5μl的SGC7901 Nuclear extract（6μg/μl）、2μl的Biotin Probe（約12.5fmol/μl）、2μl的Antibody、dd H2O補齊20μl。另外，使用過量未標記的冷探針進行競爭性實驗，即4ul的WT-probe（約12.5fmol/μl）；使用突變探針4μl的(Mut-probe)（約12.5fmol/μl）作為對照。使用相應的抗體進行超遷移率實驗（Supershift assay）。 1) 將結合反應的混合物用無菌槍頭輕輕的混合均勻，置于冰上反應20min，然后加入生物素標記的探針；室溫繼續(xù)反應20min，加入6×LoadingBuffer(Takara)4μl，上樣體積為10~30μl，100V電泳至溴酚藍于四分之三凝膠處； 2) 進行電轉前將NC膜浸泡于新鮮配制的0.5×TBE緩沖液中至少10min；以℃預冷的0.5×TBE為電轉緩沖液，在恒壓100V的條件下，至冰上進行轉膜，約45min可完成轉膠于尼龍膜上；

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3) UV BOX下，以貼近膜一面面向紫外光源，以1200×100UJ/cm2，紫外交聯(lián)5min；加入25mLBlocking Buffer ，以約70rpm在脫色搖床上封閉30min； 4) 將66.7μl穩(wěn)定的鏈霉親和素（SA-HRP）以1:300稀釋于20ml Blocking Buffer，脫色搖床70rpm共軛結合作用20min； 5) 加入1×洗膜緩沖液，洗膜過程全部在脫色搖床上進行（140prm)，完畢后wash buffer 30ml洗滌4次，西北EMSA_西安EMSA_西安淳風生物科技有限公司，每次15min； 6) 將膜用濾紙稍適吸干配制1:1稀釋的發(fā)光反應液（Thermo公司，EMSA化學發(fā)光試劑盒）均勻的鋪于NC膜上，作用1-5min，趕走氣泡，于LAS4000上采集圖像，檢測信號。 實驗原理 EMSA是一種研究轉錄因子與DNA結合的實驗技術, 可用于定性和定量分析。通常將純化的蛋白和同位素或生物素標記的DNA探針共同孵育, 然后在非變性聚丙烯凝膠上電泳, 從而將DNA-轉錄因子復合物與不結合的探針分離。由于分子量變大, DNA-轉錄因子復合物比不結合的探針遷移速度慢, 因此轉錄因子結合標記探針后使自由探針含量減少。研究者通常按照上述2個標準判斷轉錄因子是否結合DNA。

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