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GST-Pull down是在體外驗證兩種蛋白質結合的方法之一，其原理是目的蛋白與GST融合表達，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支持物，起到“誘餌蛋白”的作用。目標蛋白溶液通過柱子，呼和浩特GST-pull down實驗外包_長春GST-pull down技術服務_西安淳風生物科技有限公司，從中可以捕獲相互作用的“捕獲蛋白”（目標蛋白）。結合物洗脫后，通過蛋白質印跡(WB)分析證實了兩種蛋白質之間的相互作用。“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”都可以通過細胞裂解物、純化蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉錄和翻譯系統(tǒng)獲得，呼和浩特GST-pull down實驗外包_杭州GST-pull down技術服務_西安淳風生物科技有限公司，這種方法簡單易操作。實驗操作流程如下：

1. 誘導與轉化：

將制備好的分別帶GST和His標簽的質粒轉化至BL21感受態(tài)細胞中

A.質粒加入細菌

B.冰上30min

C. 42℃水浴5s或1min

D.向轉化混合物中加入500μL LB，不加抗生素，160 rpm 37 ℃搖床振蕩1h

E.涂板隔夜培養(yǎng)；pGEX用A板，呼和浩特GST-pull down實驗外包_上海GST-pull down公司_西安淳風生物科技有限公司，pET用K板

F.挑選陽性克?。ㄒ锔鶕约鹤龅馁|粒選擇）

G.將陽性克隆加入至3 mL LB培養(yǎng)液，220 rpm 37 ℃過夜小搖

H.取200 μL菌液加入20 mL LB培養(yǎng)液（50 mL離心管內），1:1000分別加入氨芐西林（pGEX）及卡那霉素（pET-28a）220 rpm 37 ℃ 4-6小時

I.菌液呈渾濁狀后檢測OD值，OD值0.6時加入0.5 mM的IPTG，繼續(xù)搖菌4小時

J. 5000 rpm離心10min后收集菌體，去除上清

2. 裂解細菌：

A.向菌體中加入1 mL含1x蛋白酶抑制劑的BC100緩沖液（不含Triton X-100）重新懸浮細菌。

B.將步驟A中的菌體懸液轉移至1.5 mL EP管中，置于冰上。超聲裂解細菌，超聲30秒，冰上靜置30秒，共反復5次。

C.超聲后加入110 μL 10% Triton X-100, 4 ℃震蕩1h。

D. 4 ℃，12000 rpm離心30分鐘。收集上清液。

E.取20 μL上清，加入loading buffer，煮蛋白后SDS凝膠電泳，以考馬斯亮蘭染色檢測蛋白表達。留40 μL裂解液作為input。

3. GST融合蛋白的純化：

A.清洗beads:用含0.1% Triton X-100的BC100緩沖液洗20 μL GST-sepharose beads，5000 rpm離心30秒2次，共清洗3次。

B.重懸beads:以BC100緩沖液1：1重懸GST-sepharose beads。

C.孵育蛋白：將GST融合蛋白裂解液加入洗滌后的GST-sepharose beads中。4 ℃震蕩孵育1小時。

D.收集beads: 5000 rpm離心30秒，兩次，沉淀beads。

E.清洗beads:吸出上清，用1 mL BC500緩沖液（含1% Triton X-100，不含蛋白酶抑制劑）清洗beads 3次。5000 rpm離心30秒，兩次，沉淀beads。

F.清洗beads:以1 mL BC100緩沖液（含0.1% Triton X-100，不含蛋白酶抑制劑）清洗beads 3次。5000 rpm離心30秒，兩次，沉淀beads

G.以300 μL BC100緩沖液重懸beads（含0.1% Triton X-100）。

4. His融合蛋白的純化：

采用His-tagged protein purification Magbeads（Absin,中國）進行His融合蛋白的純化，按照制造商的使用說明進行操作。

A.取0.3 mL的磁珠，磁性分離，washing buffer清洗3次。

B.細菌裂解液加入磁珠中，4 ℃震蕩孵育1小時，washing buffer清洗3次，每次清洗后均磁性分離磁珠。

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C.在磁珠中加入400 μL Elution buffer，室溫震蕩2分鐘，磁性分離收集洗液。反復3次。

D.將3次中收集到的液體用10K的超濾管進行濃縮，5000 g，離心15分鐘，加入500 μL BC100緩沖液進行緩沖液置換，5000g，離心15分鐘，收集到50-100 μL濃縮蛋白。

5. 蛋白結合及檢測：

A.純化蛋白結合：向GST及GST-DNMT3L beads中分別加入10 μL His-USP46純化蛋白，4 ℃震蕩孵育1小時，5000 rpm離心30秒，兩次，沉淀beads。

B.吸出上清。以1 mL BC100緩沖液（含0.1% Triton X-100）清洗beads 3次。

C.加入1 x loading buffer 50 μL，連同input樣本，95 ℃金屬浴5 min。離心分離beads，取上清進行Western blot檢測。

▼背景說明 蛋白互作在細胞生命活動中起著關鍵作用, 在不同時空層面上參與多種細胞過程, 因此研究蛋白互作對于理解分子調控網絡至關重要。通常情況下, 利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選植物蛋白互作必須利用體外和體內系統(tǒng)進行驗證。Pull-down就是驗證植物蛋白互作的常用技術，被廣泛用于體外驗證蛋白間的直接互作。 ▼應用場景 Pull-down 技術, 也叫蛋白質體外結合實驗, 是一種行之有效的驗證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗技術。 ▼實驗原理 將靶蛋白-GST 融合蛋白親和固化在谷胱甘肽標記的珠子上, 作為與目的蛋白親和的支撐物, 充當“誘餌蛋白”, 目的蛋白溶液與之孵育, 可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白), 洗脫結合物后通過 SDS-PAGE 電泳分析, 從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白, 誘餌蛋白和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。在Pull-down 實驗中, 設計恰當的對照實驗非常重要, 該對照可以是表達有GST (非誘餌融合蛋白)的轉化細胞裂解物, 也可以是將 GST 加到非轉化細胞的裂解物中。 GST 融合蛋白 Pull-down 的方法可以用來鑒定能與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質, 也可以鑒定2個已知蛋白質之間是否存在相互作用。此方法簡單易行, 操作方便。但Pull-down 的結果并不能真實的反應蛋白質之間的相互作用, 因為在活體內它們不一定在亞細胞空間上能碰到, 所以并不意味著在生理條件下一定結合。 （1） 將表達GST融合蛋白（實驗組）和GST（對照組）的質粒分別轉入BL21菌株中。 （2） 分別挑取陽性單克隆于3ml含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37度，200轉，過夜培養(yǎng)。 （3） 將過夜培養(yǎng)的3ml菌液接入300ml（1:100）含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37度，200轉，2.5-3h，搖至OD600=0.8左右。 （4） 取出0.5ml菌液于4度保存作為誘導前菌液。 （5） 同時在剩余菌液中加入終濃度為1mM/L的IPTG，16-27度，100-200轉，誘導8-16h。 （6） 誘導后取出0.5 mL 菌液于4°C 保存作為誘導后菌液; （7） 4°C, 6 000 rpm, 離心15 分鐘, 收集誘導后菌體, 用20 mL PBS 溶液重懸菌體后, 轉移至50 mL 離心管中; （8） 4°C, 6 000 rpm, 10 分鐘, 倒掉上清, 液氮速凍, –80°C 保存用于純化; （9） 4°C, 10 000 rpm, 2 分鐘, 收集誘導前菌液和誘導后菌液, 用80 μL1XSDS 上樣緩沖液重懸菌體; （10） 100°C, 煮沸樣品5 分鐘, 12 000 rpm, 離心2 分鐘, 取上清對誘導結果進行SDS-PAGE 檢測。 50% GST Sepharose 4B slurry的準備 （11） 將原75% Glutathione Sepharose 4B slurry 彈至均勻; （12） 取677 μL 原液/管, 3 000 rpm, 離心5 分鐘, 棄上清; （13） 加500 μLPBS, 顛倒混勻, 3 000 rpm, 離心5 分鐘, 棄上清, 反復5 次; （14） 加500 μLPBS, 顛倒混勻, 配成50% Glutathione Sepharose 4B 備用。 100mM IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存。 5.1.3 GST融合蛋白的純化 （15） 從–80°C 冰箱中拿出凍存的樣品, 冰浴溶解菌體后, 加入4 mL PBS 和40 μL PMSF(100 mmol.L–1)和40 μL 蛋白酶抑制劑Cocktail (100X)進行充分重懸;（還有這種做法：每升菌液約以50 mL PBS重懸，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巰基乙醇（v/v），PMSF（終濃度1 mM）） 細胞裂解需要采用溫和的裂解條件（問下天地人和細胞裂解液配方GST的）。為了不破壞細胞內存在的蛋白與蛋白之間的相互作用, 多采用非離子變性劑(NP-40 或Triton X-100), 不能采用高濃度的變性劑(0.2% SDS),細胞裂解液中要添加各種酶的抑制劑。 （16） 超聲破碎, 頻率: 100~200 瓦; 超聲40 秒, 停止20 秒, 共5 次(菌體由渾濁變?yōu)槌吻?; （17） 4°C, 15 000 rpm 離心40 分鐘; （18） 冰上轉移細胞裂解液上清至潔凈的10 mL 離心管中; （19） 在細胞裂解液上清中加入50 μL 50% Glutathione Sepharose 4B, 4°C, 靜音混合器上溫和旋轉孵育30–60 分鐘; （20） 3 000 rpm 離心5 分鐘, 棄上清, 此時Sepharose 上即結合了GST融合蛋白或GST; （21） 在管中加入預冷的500 μL PBS (沿壁加入, 動作輕柔, 以免打斷珠子與蛋白的聯(lián)接), 輕晃懸浮珠子, 將Sepharose 洗滌1 次, 3 000 rpm 離心3 分鐘, 棄上清; （22） 反復用PBS 洗滌3 次(最后用小槍吸凈珠子表面水膜), 即獲得結合有GST 融合蛋白或GST 的Sepharose, 用大口徑的移液槍頭轉移至1.5 mL 尖底離心管中; （23） 如果用于檢測, 在Sepharose 加入15–20 μL1xSDS 蛋白上樣緩沖液, 在沸水中煮3分鐘, 12 000 rpm 離心1 分鐘, 取上清作SDS-PAGE 電泳; （24） 如果用于Pull-down 檢測, 繼續(xù)后續(xù)操作。

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