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Invitrogen核/膜系統(tǒng) 一、 實驗原理： 真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—binding domain，太原酵母單雜交文庫構(gòu)建，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構(gòu)建與基因的ORFs融合的激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD融合構(gòu)建載體，分別轉(zhuǎn)化酵母細胞。在酵母內(nèi)表達的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報告基因的表達，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。基因轉(zhuǎn)錄實際上是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結(jié)果，這種結(jié)合猶如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質(zhì)互作的基礎(chǔ)。 實驗步驟： 1.1 RNA提取 1.2 mRNA分離 1.3 cDNA初級文庫的構(gòu)建 1.3.1 cDNA一鏈的合成 1.3.2 cDNA第二鏈的合成 1.3.3 cDNA adapter的制備 1.3.4 cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份) 1.3.5 cDNA分級分離 1.3.6 BP重組 1.3.7 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B 1.3.8 文庫克隆檢測 1.3.9 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定 1.4 cDNA次級文庫的構(gòu)建 1.4.1 初級文庫的質(zhì)粒抽提 1.4.2 LR重組 1.4.3 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B 1.4.4 文庫克隆檢測 1.4.5 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定 三、實驗結(jié)果： 次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。

長春雙熒光素酶報告基因技術(shù)服務(wù)_鄭州醫(yī)藥、保養(yǎng)-西安淳風(fēng)生物科技有限公司
酵母單雜交技術(shù)最早是1993年由Li等從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來，西安淳風(fēng)生物科技有限公司,西安淳風(fēng)生物科技有限公司,通過對報告基因的表型檢測，分析DNA與蛋白之間的相互作用，采購太原酵母單雜交文庫構(gòu)建,鄭州醫(yī)藥、保養(yǎng)，以研究真核細胞內(nèi)的基因表達調(diào)控。由于酵母單雜交方法檢測特定轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件專一性相互作用的敏感性和可靠性，現(xiàn)已被廣泛用于克隆細胞中含量微弱的、用生化手段難以純化的特定轉(zhuǎn)錄因子。 酵母單雜交(Yeast one-hybrid)是根據(jù)DNA結(jié)合蛋白(即轉(zhuǎn)錄因子)與DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報道基因表達的原理，克隆與靶元件特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因(cDNA)的有效方法。其理論基礎(chǔ)是:許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活子由物理和功能上獨立的DNA結(jié)合區(qū)(DNA-binding domain BD)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(Activation domain AD)組成，因此可構(gòu)建各種基因與AD的融合表達載體，太原酵母單雜交文庫構(gòu)建,更實惠醫(yī)藥、保養(yǎng)，在酵母中表達為融合蛋白時，根據(jù)報道基因的表達情況，便能篩選出與靶元件有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。理論上，在單雜交檢測中，任何靶元件都可被用于篩選一種與之有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。

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