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產(chǎn)品詳情
面議

產(chǎn)品名稱: 雙熒光素酶報告基因

雙熒光素酶報告基因

產(chǎn)品價格:面議

產(chǎn)品數(shù)量:1

保質(zhì)/修期:1

保質(zhì)/修期單位:

更新日期:2020-03-05

產(chǎn)品說明

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒╨uciferase Assay)目前由兩個主要的應(yīng)用方向,一是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用,轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達功能的蛋白質(zhì)分子,也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異順序結(jié)合,這些特異性的序列被稱為順式因子,轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式因子實現(xiàn)共價結(jié)合,從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因?qū)嶒灒╨uciferase Assay)是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段,第二是研究微小RNA(microRNA)對于靶基因的調(diào)控,通過生物信息學(xué)方法預(yù)測microRNA潛在的靶基因以及干預(yù)位點序列,咨詢呼和浩特雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?貴陽醫(yī)藥、保養(yǎng),并設(shè)計合適的microRNA質(zhì)?;蚋深A(yù)片段,同時構(gòu)建靶基因的報告基因質(zhì)粒,二者同時轉(zhuǎn)染細胞,這是確定microRNA是否能影響(上調(diào)或下調(diào))靶基因的首選研究方法。 實驗原理: 1)構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質(zhì)粒,如pGL3-basic(轉(zhuǎn)錄因子與靶基因)或pMIR-REPORT Luciferase質(zhì)粒(微小RNA與靶基因) 2) 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒(或microRNA質(zhì)粒)與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞或目的細胞。如果此轉(zhuǎn)錄因子(或microRNA)能夠激活靶啟動子,則熒光素酶基因就會表達,熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比。 3) 加入特定的熒光素酶底物,熒光素酶與底物反應(yīng),產(chǎn)生熒光素,通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性,從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。 實驗步驟(動物): (1) 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。 (2) 設(shè)計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段,將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒中。 (3) 篩選陽性克隆,測序,擴增克隆并提純質(zhì)粒備用。 (4) 擴增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒(或microRNA質(zhì)粒),提純備用,西安淳風生物科技有限公司,西安淳風生物科技有限公司,同時準備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照。 (5) 培養(yǎng)293細胞(或其它目的細胞),并接種于6孔板中,生長24小時(80%匯合度)。 (6) 將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞。 (7) 用適當?shù)姆椒ㄌ崛〉鞍撞⒂糜跓晒馑孛笝z測。 (8) 加入酶作用底物,于熒光計數(shù)儀上測定熒光素酶的活性。 (9) 計算相對熒光強度,做呼和浩特雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?貴陽醫(yī)藥、保養(yǎng),并與空載對照比較,判斷影響因子是否有效的作用于靶基因。 實驗步驟(植物): 1. 挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)。 2. 將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中(加有與1相同的抗生素)。加入乙酰丁香酮和MES,28度搖床培養(yǎng)。 3.離心收集菌體。 4. MgCl2重懸菌體加入AS。 5. 取正處于生長期的煙草葉片,使用針頭在葉片反面扎些小孔。 6. 將侵染液裝入5 ml 注射器內(nèi),用拇指按壓注射器反板將液體從葉片下表皮注射到煙草葉片內(nèi)。注射后,煙草葉片會出現(xiàn)濕潤的現(xiàn)象。 7. 注射后熒光素酶檢測試劑盒(Dual-Luciferase Assay System, Promega公司)(具體步驟詳見說明書)在promega發(fā)光檢測儀(Promega Glomax 2020)分析熒光素酶活性。 8. 根據(jù)雙報告系統(tǒng)測得的熒光值,算出目的基因質(zhì)粒的熒光值/內(nèi)參質(zhì)粒熒光值(即F/R值),并算出相對于對照組的比值,找呼和浩特雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?西安醫(yī)藥、保養(yǎng),求出標準誤,作出直方圖。
貴陽亞細胞定位公司_質(zhì)量保障醫(yī)藥、保養(yǎng)-西安淳風生物科技有限公司
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